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黃曲霉毒素M1免疫親和柱操作說明書
【概要】
黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃分為1類致癌物，同時又是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，廣泛存在于各種食物中。玉米，花生，大米，小麥等谷物及其副產(chǎn)品是黃曲霉毒素的主要來源，同時飼料中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過動物代謝后產(chǎn)生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強的毒性和致癌性，也廣泛存在牛奶，血液，組織等食品中。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是胃癌，腸癌等疾病的主要原因，對人類的健康構(gòu)成很大威脅。世界各國對食品，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴格的限量標準。2010年6月1日開始施行的乳品安全國家標準中對乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測進行了規(guī)定，主要使用的樣品前處理方法就是免疫親和柱凈化法。
【適用范圍及性能】
用于定性、定量檢測牛奶，奶粉，發(fā)酵乳，干酪，奶油等樣品中黃曲霉毒素M1的樣品前處理。
柱容量：≥200ng
回收率：≥90%
【試驗原理】
本產(chǎn)品的測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應，黃曲霉毒素M1單克隆抗體連接在柱內(nèi)凝膠上，樣品中的黃曲霉毒素M1經(jīng)過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢的通過黃曲霉毒素M1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內(nèi)，毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他物質(zhì)。用甲醇洗脫黃曲霉毒素M1，然后注入到分析儀器中用于檢測。
【包裝組成】
根據(jù)不同規(guī)格，每一個盒中包含5-25支黃曲霉毒素免疫親和層析柱及1份說明書。
【需要而未提供的設備及試劑】
設備：
┅┅高速均質(zhì)器或組織勻漿機
┅┅粉碎機
┅┅200mL/50mL量筒
┅┅天平：感量0.1g
┅┅酸度計
┅┅分液漏斗
┅┅微量移液器：單道 100?L～1000?L
┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）
┅┅50mL漏斗
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀
┅┅一次性玻璃試管
┅┅泵流操作架（包括空氣泵，不同容積的玻璃注射器等）
┅┅燒杯，容量瓶，錐形瓶等
試劑：
┅┅甲醇（色譜級）
┅┅乙腈（色譜級）
┅┅石油醚
┅┅蒸餾水或去離子水
┅┅氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）稱取2g氫氧化鈉溶解于100mL水中
【樣本處理步驟】
（一）牛奶
┅┅將100mL牛奶水浴加熱至40 oC；
┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用
（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品
┅┅稱取10g奶粉樣品，將100mL50 oC水多次少量加入，攪拌，使奶粉充分溶解
┅┅6000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用
（三）發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)
┅┅稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調(diào)pH至7.4；
┅┅用高速均質(zhì)器在 9500 轉(zhuǎn)/分鐘下告訴勻漿5 min
┅┅水浴加熱至40 oC；
┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用
（四）干酪
┅┅稱取經(jīng)切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；
┅┅用高速均質(zhì)器在 9500r/分鐘下告訴勻漿5 min；
┅┅超聲提取30 min；
┅┅在6000r/分鐘下離心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。
┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3），振搖2 min；
┅┅待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。
┅┅重復用石油醚提取2次；。
┅┅將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL；┅┅濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中；
┅┅加水稀釋至約50 mL，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理。
（五）奶油
┅┅稱取5g試樣，置于50 mL燒杯中；
┅┅用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。
┅┅加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中；
┅┅待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供凈化處理。
【親和柱凈化步驟】
┅┅將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL清澈液注入玻璃注射器；
┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；
┅┅在注射器中加入10ml水，調(diào)節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。
┅┅準確加入1mL色譜級乙腈洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
【結(jié)果判定】
經(jīng)免疫親和柱凈化后，收集到的乙腈洗脫液可直接使用熒光計或者HPLC檢測，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。收集到的1ml洗脫液中的黃曲霉毒素含量相當于10ml牛奶樣品、發(fā)酵乳樣品或者1g奶粉樣品、干酪樣品和奶油樣品中黃曲霉毒素M1的含量。
如果HPLC檢測需要其它溶劑，可以將乙腈洗脫液氮氣吹干，然后復溶
【注意事項】
┅┅黃曲霉毒素危害極大，應戴手套操作。
┅┅使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用5%濃度的次氯酸鈉溶液浸泡過夜。
┅┅不要使用過了有效日期的免疫親和柱。
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：親和柱可于常溫保存，2-8℃儲存可延長有效期，不可凍存。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。
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