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玉米赤霉烯酮(Ⅰ型)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書
【概要】
玉米赤霉烯酮(Zearaleaone)又稱F-2毒素，是玉米赤霉菌的代謝產(chǎn)物，具有雌激素樣作用，具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，對(duì)家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。
【適用范圍】
可定性、定量檢測(cè)谷類、啤酒及飼料等樣本中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅俊?
【試驗(yàn)原理】
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA，在微孔板上預(yù)包被玉米赤霉烯酮抗原，加入樣本/玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的玉米赤霉烯酮與預(yù)包被在微孔板上的玉米赤霉烯酮抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去。再加入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物玉米赤霉烯酮抗原的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物玉米赤霉烯酮的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：0.2ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
玉米赤霉烯酮 …………………………………………………………… 100%
α-玉米赤霉醇 …………………………………………………………… 75%
β-玉米赤霉醇 …………………………………………………………… 61%
α-玉米赤霉烯醇 ………………………………………………………… 103%
β-玉米赤霉烯醇 …………………………………………………………… 83%
玉米赤霉酮 ………………………………………………………………… 75%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.2ppb, 0.6ppb, 1.8ppb, 5.4ppb, 16.2ppb
3. 酶標(biāo)物 1瓶 ………………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 ………………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ……………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（10×） 1瓶………………… 20ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅粉碎機(jī)
┅┅離心機(jī)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：?jiǎn)蔚?20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
試劑：
-----甲醇
----去離子水（或蒸餾水）
【試劑配制】
1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。
2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。
3. 50％甲醇：取無水甲醇，用去離子水以1:1體積比例稀釋（1份無水甲醇＋1份水）。
4. 40％甲醇：取無水甲醇，用去離子水以4:6體積比例稀釋（4份無水甲醇＋6份水）。
【樣本前處理步驟】
一、 谷物（稀釋倍數(shù)：10）
1. 取1g粉碎樣品，加入4ml 50％甲醇；
2. 劇烈振蕩5min；
3. 4000g離心5min；
4. 取上清液400μl，加入600μl樣本稀釋液，混勻；
5. 取稀釋后液體待測(cè)。
二、啤酒（稀釋倍數(shù)：10）
1. 取待測(cè)啤酒，除凈氣體（60℃水浴或振蕩去除）；
2. 取1ml啤酒，加入4ml40%甲醇；
3. 劇烈振蕩5min；
4. 取上述液體500μl，加入樣本稀釋液500μl，混勻；
5. 取稀釋后液體待測(cè)。
三、飼料（稀釋倍數(shù)：200）
1. 取0.5g粉碎樣本，加入20ml無水甲醇；
2. 充分振蕩5min；
3. 5000rpm離心5min；
4. 取上清液100μl加入樣本稀釋液400μl混勻；
5. 取稀釋后液體待測(cè)。
【檢測(cè)步驟】
一、 測(cè)定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋
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